Ing. Ludmila Trojáková: Studium vybraných přírodních antioxidantů
Školitel: Prof. Ing. Jan Pokorný, DrSc.
Studijní program: Chemie a technologie potravin
Studijní obor: Chemie a analýza potravin
Datum obhajoby: 25.10.2001

SOUHRN

Studiu přírodních antioxidantů je celosvětově věnována pozornost již řadu let, často je však velmi obtížné údaje z jednotlivých prací porovnávat a výsledky těchto pokusů aplikovat do potravinářské praxe. Z tohoto důvodu je tato disertační práce zaměřena především na vytvoření podmínek pro komplexní studium přírodních antioxidantů na jednom pracovišti.

• Pro stanovení antioxidační účinnosti byla validována analytická metoda využívající přístroj Oxipres, který se osvědčil pro měření účinnosti antioxidantů nejen v samotných tucích a olejích, ale také v potravinových systémech na ně bohatých. Hodnoty získané touto metodou (při 100 °C) byly korelovány s hodnotami získanými metodou podle Schaala (při 40 a 60 °C), přičemž byl zjištěn statisticky významný vztah mezi oběma těmito metodami.
• Byly vyvinuty a validovány analytické metody pro stanovení přírodních antioxidantů, jakými jsou tokoferoly, karnosol a karnosová kyselina (specifické antioxidanty šalvěje a rozmarýny) a karvakrol (specifický antioxidant saturejky). Základem všech použitých metod je vysokoúčinná kapalinová chromatografie v reverzním uspořádání s amperometrickou detekcí, která je specifická právě pro detekci antioxidantů. Protože nebyly dostupné standardy karnosolu a karnosové kyseliny, byly tyto látky izolovány z lístků rozmarýny a čistota izolovaných antioxidantů byla ověřena pomocí nukleární magnetické rezonance. Správnost metody pro stanovení jednotlivých tokoferolů v tucích a olejích byla ověřena v rámci mezinárodního srovnávacího testu. Mez stanovitelnosti *-tokoferolu v rostlinných olejích je 10 mg/kg oleje.
• V rámci sledování antioxidační účinnosti byla věnována největší pozornost extraktům šalvěje, rozmarýny a saturejky. Zkoumány byly nejen extrakty připravené za laboratorních podmínek (s použitím různých rozpouštědel), ale i komerčně dostupné preparáty na bázi rozmarýny. Extrakty šalvěje a rozmarýny (kromě čištěných extraktů) měly v sádle (v koncentraci 0,05 %) vysokou účinnost, a to jak extrakty připravené v laboratoři, tak komerční preparáty. Při stabilizaci řepkového oleje byly tyto extrakty také účinné, ale mnohem méně než v sádle, kde byly asi 8-krát účinnější. Ve slunečnicovém oleji byly ještě méně účinné (přibližně 14-krát méně než v sádle). U všech výše jmenovaných substrátů byla účinnost některých extraktů (při koncentraci 0,05 %) srovnatelná s účinkem syntetického antioxidantu BHT (při koncentraci 0,02 %).
• Při sledování vlivu teploty na účinnost extraktů šalvěje a rozmarýny bylo zjištěno, že jejich účinnost s rostoucí teplotou klesá, ale rychlosti poklesu účinnosti se lišily v závislosti na použitém extrakčním rozpouštědle. Relativně vysoká účinnost extraktu rozmarýny byla zjištěna při stabilizaci řepkového oleje za vysoké teploty (150 °C) a při stabilizaci majonéz, kde byla účinnost ethanolového extraktu rozmarýny dokonce vyšší než účinnost BHA. Naproti tomu v modelových směsích řepkového oleje s celulosou a albuminem byla antioxidační účinnost extraktů šalvěje a rozmarýny snížena vlivem netukového materiálu přibližně na 30 %, ve srovnání s účinností v samotném oleji.
• Při sledování degradace jednotlivých tokoferolů v řepkovém oleji, oxidovaném za různých teplotních podmínek, byl zjištěn pomalejší úbytek a-tokoferolu v přítomnosti rozmarýnového extraktu. Na zpomalení jeho úbytku měla vliv zejména karnosová kyselina, která se rozkládala dříve než a-tokoferol. Karnosol se na zpomalení degradace tokoferolů pravděpodobně nepodílí, i když má antioxidační účinnost v tukovém substrátu.
• Zkoumáním antioxidační účinnosti extraktů saturejky se zjistilo, že jejich účinnost je ve srovnání s extrakty šalvěje a rozmarýny mnohem nižší.
• Byl nalezen vztah mezi složením extraktů šalvěje, rozmarýny a saturejky a jejich antioxidačním působením. Pokud nejsou brány v úvahu synergické a antagonické interakce, způsobují karnosol a karnosová kyselina více než 100 % účinnost extraktů šalvěje a rozmarýny. To lze vysvětlit zejména přítomností látek s prooxidačním účinkem, jejichž působení se jeví nejvýznamnější u ethanolových extraktů. Antioxidační aktivitu extraktů saturejky způsobuje hlavně karvakrol, podstatně méně tokoferoly, fosfolipidy a p-cymen-2,3-diol, který je velmi účinným antioxidantem např. v tymiánu, a v rámci této práce byl zjištěn také v saturejce.
• Zkoumány byly také nové zdroje přírodních antioxidantů, kterými byly extrakty rostlin tradičně používaných v lidovém léčitelství pro přípravu čajů (tj. heřmánek, lípa, jahodník, maliník, ostružiník, kopřiva, meduňka, mateřídouška a šípek). Účinnost většiny extraktů, stanovená v sádle pomocí přístroje Oxipres při 100 °C, byla velmi nízká, a tedy pro potravinářský průmysl pravděpodobně nevýznamná. Z výživového hlediska však mohou být tyto rostliny významným zdrojem přírodních antioxidantů. Nejvýraznější účinnost ze zkoumaných rostlin vykazovaly meduňka, mateřídouška a lípa.

Ing. Ludmila Trojáková: Study of the selected natural antioxidants
Supervisor: Prof. Ing. Jan Pokorný, DrSc.
Study programme: Food chemistry and technology
Study subprogramme: Food chemistry and analysis
Date of defence: 25.10.2001

SUMMARY

Worldwide attention has been paid to studing natural antioxidants for many years. However, it is very difficult to compare the data of individual studies and to apply the results of these studies to food practice. Therefore this dissertation focuses primarily on designing the conditions for the complex research of natural antioxidants in one workplace.

• The analytical method using the Oxipres apparatus was validated for determination of the antioxidant activity. This apparatus is used for the determination of the oxidative stability of fats and oils, but also for foods containing fat. The results obtained by this method (at 100°C) were correlated with results obtained using Schaal Oven Test (at 40 and 60°C). Statistically significant relations between these two methods were found.
• Analytical methods for the determination of natural antioxidants, i.e. tocopherols, carnosol and carnosic acid (the specific antioxidants of sage and rosemary), and carvacrol (the specific antioxidant of savory), were developed and validated. All the methods used were based on reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) with electrochemical detection. This particular detection is specific for antioxidants. Standards of carnosol and carnosic acid were not readily accessible, therefore these compounds were isolated from leaves of rosemary. The purity of these standards was verified by nuclear magnetic resonance spectrometry. Trueness of the method for determination of individual tocopherols in fats and oils was verified by means of interlaboratory comparison test. The limit of determination of *-tocopherol is 10 mg/kg in edible oils.
• The greatest attention was devoted to extracts of sage, rosemary and savory, and their antioxidant activity. For testing the antioxidant activity were used not only extracts prepared in laboratory (extraction by different solvents) but also commercial products containing rosemary. Extracts of sage and rosemary (except for purified extracts), both extracts prepared in laboratory and commercial products, were very effective (at the 0.05% level) in the stabilization of pork lard. The extracts prepared in laboratory were also effective in the stabilization of rapeseed oil. Their activities, however, were lower than those in lard, in which they were approximately 8 times more effective. These extracts were much less effective in the stabilization of sunflower oil (approximately 14 times less than in lard). The antioxidant activities of some extracts (at the 0.05% level), however, were comparable to the activity of synthetic antioxidant BHT (at the 0.02% level) in all tested substrates.
• The effect of temperature on antioxidative action of sage and rosemary extracts was also studied. The antioxidant activities of these extracts decrease with increasing temperature. However, different solvents used for extraction had an influence on the rate of decrease of antioxidant activities of these extracts. The relatively high antioxidant activity of a rosemary extract was found in the stabilization of rapeseed oil at high temperature (150°C) and in the stabilization of mayonnaise, in the latter the activity of ethanol extract of rosemary was even higher than that of BHA. On the other hand, antioxidant activities of sage and rosemary extracts decreased approximately to 30% in model mixtures of rapeseed oil with nonlipidic substrates (influenced by nonlipidic substrate) in comparison with activity in oil itself.
• a-Tocopherol present in rapeseed oil, that was oxidized under different temperature conditions, was degraded slowly in the presence of a rosemary extract. Carnosic acid, especially, had influence on slow degradation of a-tocopherol, because it is degraded sooner than a-tocopherol. Carnosol may not take part in slowing down the degradation of tocopherols, even though it has antioxidant activity in fat substrate.
• Antioxidant activity of tested savory extracts was far lower in comparison with activities of sage and rosemary extracts.
• The relation between the composition of sage, rosemary, savory extracts and their antioxidant activities was found. Carnosol and carnosic acid account for more than 100% of antioxidant activities of sage and rosemary extracts (synergistic and antagonistic interactions were not taken into account), which could be explained by the presence of prooxidant compounds. The presence of these compounds is most significant in ethanol extracts. p-Cymene-2,3-diol, the effective antioxidant in thyme, was found also in savory. As for savory extracts, carvacrol is the compound showing the highest antioxidant activity compared with p-cymene-2,3-diol, tocopherols and phospholipids.
• New sources of natural antioxidants were also tested, such as plant extracts traditionally used in folk treatment for tea preparation (i.e. chamomile, lime, strawberry, raspberry, blackberry, nettle, balmmint, thyme, and hip). Antioxidant activity of most extracts, determined in lard using the Oxipres apparatus at 100°C, was very low, and hence the use of these plants for food stabilizing seems negligible. However, these plants can be a significant source of natural antioxidants from nutritional point of view. Balmmint, thyme and lime had the most significant antioxidant activity of investigated plants.